უპირველეს ყოვლისა, ორივე EcoR1 და Xba1 ტოვებენ 5' გადახურვას დნმ-ის მონელებისას (ისევე როგორც Nde1). ორივე შემთხვევაში 3' ბოლო ჩაღრმავებულია, რის გამოც პოლიერმაზას შეუძლია ბაზის დამატება. მეორეც, ყველა პოლიმერაზას შეუძლია ბაზის დამატება მხოლოდ 3' ბოლოზე, ასე რომ Klenow დაამატებს 4 ფუძეს ორივე ადგილის 3' ბოლოშიბლაგვი ბოლოების გენერირებისთვის.
ტოვებს შემაკავებელი ფერმენტები 5 ფოსფატს?
რესტრიქციული ფერმენტების მიერ მონელებული ვექტორები და ჩანართები შეიცავს აუცილებელ ტერმინალურ მოდიფიკაციას (5'ფოსფატი და 3'ჰიდროქსილი), ხოლო პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის (PCR) მიერ შექმნილი ფრაგმენტები შეიძლება არა.
შეიძლება თუ არა ბლაგვი ბოლოების დამაგრება?
ბლაგვი ბოლოთი
ბლაგვი ბოლოების ლიგირება არ გულისხმობს ამობურცული ბოლოების ფუძის დაწყვილებას, ამიტომ ნებისმიერი ბლაგვი ბოლო შეიძლება იყოს მიბმული სხვა ბლაგვი ბოლოზე. ბლაგვი ბოლოები შეიძლება წარმოიქმნას შემაკავებელი ფერმენტების მიერ, როგორიცაა SmaI და EcoRV.
Taq პოლიმერაზა წარმოქმნის ბლაგვ ბოლოებს?
დიახ… Taq პოლიმერაზა ამატებს A-Overhangs-ს, თუ PCR-ზე საბოლოო გაფართოების საფეხურს შეინარჩუნებთ 72 dC-ზე. ძირითადად გამოიყენება TA კლონირებისთვის.
რატომ გამოვიყენოთ Klenow ფრაგმენტი დნმ-ის თანმიმდევრობის დროს?
კლენოვის ფრაგმენტი ძალზე სასარგებლოა კვლევაზე დაფუძნებული ამოცანებისთვის, როგორიცაა: ორჯაჭვიანი დნმ-ის სინთეზი ერთჯაჭვიანი შაბლონებიდან . დნმ-ის ფრაგმენტების 3' ბოლოების შევსება, რათა მოხდეს 5' გადახურვის ბლაგვი . მონელება ამოწურული 3' გადახურვის.
